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Click EdU細胞增殖檢測試劑盒(染料可以定制)

產品組成：

保存條件：
         -20℃保存，一年有效。特異性熒光染料和PI須避光保存

產品簡介：

Click EdU細胞增殖檢測試劑盒(Click EdU Cell Proliferation Kit with Dye)，是一種基于DNA合成過程中胸腺嘧啶脫氧核苷(thymidine)類似物EdU(5-ethynyl-2' -deoxyuridine)的摻入，并通過隨后的點擊反應(Click reaction)使EdU被Dye所標記，從而實現簡單、快速、高靈敏地檢測細胞增殖的試劑盒。
本試劑盒可以檢測到細胞或組織樣品中單個的增殖細胞，同時也可以對細胞或組織樣品總體的細胞增殖情況進行定量檢測。本試劑盒可以檢測培養的細胞或組織樣品，也可以檢測組織切片。
經本試劑盒處理后，增殖的細胞在熒光顯微鏡下呈現非常明亮的藍色熒光，可以用于熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、流式細胞儀（須配有DAPI檢測通道）或熒光酶標儀檢測，也可以用于高內涵篩選(High-Content Screening, HCS)。流式細胞儀或熒光酶標儀檢測僅適用于細胞樣品，不適用于組織切片。
細胞增殖能力的檢測是評估細胞活性、基因毒性和抗腫瘤藥物效果等的基本方法。公認的最精確的檢測細胞增殖的方法是直接檢測細胞中DNA的合成。最初廣泛使用的通過檢測DNA合成來檢測細胞增殖的方法是放射性標記核苷摻入法，如氚標記胸腺嘧啶脫氧核苷([³H]thymidine)摻入法。但該方法由于有放射性污染并且很難實現單細胞檢測而受到很大的限制，隨后逐漸被基于抗體檢測的BrdU(bromo-deoxyuridine)法所替代。BrdU法步驟繁多，且需要使用BrdU抗體，影響因素較多，穩定性比較差。并且由于BrdU法需要使用抗體，有時會和其它目的蛋白基于抗體的檢測相互產生干擾。EdU法基于EdU摻入和后續的點擊反應，無需使用抗體、操作便捷、檢測靈敏度高，是一種在BrdU法基礎上升級換代的新方法，將會逐步取代BrdU法。
MTT法、WST-1法、CCK-8法和CellTiter-Lumi?化學發光法都是基于細胞活性的細胞增殖檢測方法，能檢測到細胞的總體增殖效果，但無法檢測到單個的增殖細胞。這幾種方法盡管都不是檢測DNA合成的，但被廣泛用于替代[³H]thymidine摻入法。CFDA SE法，基于細胞熒光示蹤的原理能檢測到單個的增殖細胞，但由于每增殖一次熒光減弱一半，在熒光顯微鏡下較難區分熒光減弱一半的細胞，檢測靈敏度不是很高，通常僅適用于流式細胞儀檢測。在進行科學研究時，上述這些基于細胞活性或CFDA SE的方法可以作為EdU法的補充性檢測方法。
EdU(5-ethynyl-2' -deoxyuridine)，中文名為5-乙炔基-2' -脫氧尿苷，是一種新型胸苷(胸腺嘧啶脫氧核苷，thymidine)類似物，EdU可以在DNA合成過程中替代胸苷摻入到新合成的DNA中。另一方面，EdU上的乙炔基能與EdU特異性反應探針通過一價銅離子的催化發生共價反應，形成穩定的三唑環，該反應非常迅速，被稱作點擊反應(Click reaction)，通過點擊反應，新合成的DNA會被相應的熒光探針所標記，從而可以使用適當的熒光檢測設備檢測到增殖的細胞。

產品特點：

本試劑盒反應簡單、檢測靈敏度高。

本試劑盒基于簡單高效的點擊反應，無需DNA變性，只需少量的小分子EdU特異性反應探針即可非常有效地標記出摻入的EdU，并且可以檢測到單個細胞的增殖情況。
本試劑盒使用便捷、兼容性好。

本試劑盒只需常用的多聚甲醛固定和Triton X-100穿透，就可以使EdU特異性反應探針有效進入細胞并發生點擊反應，不會影響細胞形態，不會影響基于抗體的免疫熒光和免疫組化檢測，也不會影響DNA的熒光染色(如PI染色檢測細胞周期)。而BrdU法為了使大分子的BrdU抗體進入細胞并與DNA上的BrdU結合，需要對雙鏈DNA進行變性處理(如酸變性、熱變性或者DNase消化等)，這種變性可能會影響細胞形態，影響后續的免疫熒光和免疫組化檢測、DNA的熒光染色等

本試劑盒檢測快速，定性定量檢測都非常便捷。

相對于至少需要4小時的BrdU法，本試劑盒采用的Click EdU法檢測新合成的DNA只需1.5-2小時，時間上大大縮短。本試劑盒同時提供了染色細胞核的PI，以方便染色觀察所有的細胞核。可以使用熒光顯微鏡或流式細胞儀等進行定性和定量檢測。本試劑盒小包裝，如果用于培養的細胞(6孔板)的檢測，可以檢測50個樣品，每個樣品的反應體系為500μl的Click反應液；如果用于96孔板檢測，可以檢測500個樣品，每個樣品的檢測體系為50μl的Click反應液；如果用于12孔、24孔、48孔或384孔板樣品的檢測，分別可以檢測125、250、350和1250個樣品，每個樣品推薦的Click反應液用量為200μl、100μl、70μl和20μl。小包裝如果用于流式細胞儀檢測，可以檢測50個樣品，每個細胞樣品的細胞數量宜為10-100萬，每個樣品的反應體系為500μl的Click反應液。小包裝如果用于冰凍或石蠟切片的檢測，可以檢測125-250個樣品， 每個樣品的反應體系為100-200μl的Click反應液。

注意事項：
Click Additive配制成溶液后請注意適當分裝。如果溶解后有白色物質析出，請上下顛倒多次，待全部溶解后使用。如果該溶液顏色變成棕色，說明該組分的有效成分已失效，請棄用。
由于本產品需要銅離子催化進行點擊反應，請注意如下的兼容性問題及解決方案。本產品完全兼容有機類染料如Alexa Fluor^?系列普通染料及fluorescein (FITC)、Allophycocyanin (APC)及APCE-tandems染料；對于Qdot^?納米晶體探針、Horseradish peroxidase (HRP)、R-phycoerythrin (R-PE)和R-PE-tandems染料如Alexa Fluor^? 680-R-PE等，需要在點擊反應完成后進行反應和檢測；本產品會影響GFP、RFP、mCherry等熒光蛋白的熒光，對于熒光類蛋白如Green Fluorescent Protein (GFP)、FlAsH?和ReAsH?類試劑，需要在點擊反應前進行反應和檢測。由于Phalloidin (鬼筆環肽)不兼容點擊反應，推薦使用進行細胞微管的檢測。

溫馨提示：
本產品僅限于專業人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內。
為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用說明：

1. 需要用戶自行準備試劑：

1XPBS,固定液，洗滌液，通透液，超純水；蓋玻片等耗材

2.  培養細胞的EdU的標記及固定、洗滌和通透（參考）

a. 在6孔板中培養適當數量的細胞。細胞培養過夜并且恢復到正常狀態后，進行所需的藥物處理。

b. 配制2X的EdU工作液：推薦的EdU終濃度為10μM (1X)，用細胞培養液1:500稀釋EdU (10mM)即可得到2X的EdU工作液(20μM)。

注意：對于A549、HeLa和NIH/3T3等貼壁細胞，推薦EdU的使用終濃度為10μM。但細胞類型、培養液種類、細胞密度、細胞增殖速度等多方面的因素會影響EdU摻入到細胞中的量，因此初次使用時建議對EdU的使用濃度進行一定的摸索。如果之前使用過BrdU進行實驗，則可以參考BrdU的終濃度作為EdU的終濃度。

c. 將37oC預熱的2X的EdU工作液(20μM)，等體積加入6孔板中，使6孔板中的EdU終濃度變為1X。更換所有的培養液可能會對細胞的增殖有影響，因此不建議替換所有的培養液。

d. 繼續孵育細胞2小時。該孵育時間的長短取決于細胞生長速率，通常宜繼續孵育細胞周期10%左右的時間。孵育時間小于45分鐘時，建議提高EdU的濃度；孵育時間大于20小時時，建議適當降低EdU的濃度。

e. EdU標記細胞完成后，去除培養液，并加入1mL固定液(4%的多聚甲醛)，室溫固定15分鐘。

注意：對于流式細胞儀檢測，貼壁細胞胰酶消化后用培養液重懸后再固定。

f. 去除固定液，每孔用1mL洗滌液 (1X PBS) 洗滌細胞3次，每次3-5分鐘(水平搖床緩慢搖晃)。

g. 去除洗滌液，每孔用1mL通透液(0.3% TritonX-100的PBS)，室溫孵育10-15分鐘。

h. 去除通透液，每孔用1mL洗滌液洗滌細胞1-2次，每次3-5分鐘(水平搖床緩慢搖晃)。

3. EdU檢測

a. 配制Click Acceleration Solution：用1.5mL去離子水溶解一管Click Acceleration Reagent，混勻至全部溶解，即為Click Acceleration Solution。配制后可以適當分裝，并-20oC保存。

b. 參考下表配制Click反應液。注意：請嚴格按照下表中組分順序和體積配制Click反應液，否則點擊反應可能無法有效進行；同時，Click反應液須在配制后15分鐘內使用。

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